Le récit reprend exactement là où le premier
Assassin's Creed s'est arrêté : Desmond est face à des inscriptions étranges
écrites en sang sur le mur de sa chambre qu'il voit grâce à la « vision d'aigle
». Lucy entre et lui demande de rentrer à nouveau dans l'Animus. Il assiste
alors à la naissance d'un certain Ezio Auditore da Firenze. Les deux fuient
ensuite rapidement le bâtiment d'Abstergo. Arrivé à un entrepôt qui semble être
la cachette des Assassins, Lucy explique qu'elle voudrait avoir Desmond dans
leur camp. Elle lui propose de s'entraîner rapidement grâce à l'effet secondaire
de l'Animus qui lui permettra d'acquérir l'expérience d'Ezio, son ancêtre.
Desmond accepte et rencontre le reste de l'équipe : Rebecca Crane qui s'occupe
de l'Animus 2.0 des Assassins, et Shaun Hastings, tacticien et historien
sarcastique. Desmond ne tarde pas à rentrer dans la machine…
Desmond se retrouve donc à Florence, en 1476, dans la peau d'Ezio, un jeune
noble séducteur de 17 ans. On découvre sa famille, sa petite amie et ses
ennemis. Un jour, sa famille est accusée de trahison, victime d'une conjuration.
Son père et ses deux frères sont exécutés devant ses yeux. Il doit quitter la
ville avec sa mère et sa sœur, se réfugiant dans le village de Monteriggioni où
son oncle Mario tient une villa. Il lui révèle que le jeune homme est un
Assassin, tout comme son père qui a été tué par les Templiers. Il débute alors
sa quête de vengeance contre ceux qui ont tué les membres de sa famille. Sa
longue aventure de 20 ans l'amène à voyager à travers diverses villes d'Italie
telles que Venise et Forlì, et l'implique dans des évènements historiques comme
la conjuration des Pazzi ou, dans un contenu supplémentaire du jeu, le Bûcher
des Vanités. Au fur et à mesure qu'il poursuit sa quête, il se rend compte qu'il
est au centre d'une prophétie inscrite sur le codex de son ancêtre Altaïr.
En 1499, il se rend à Rome afin d'assassiner le pape Alexandre VI, alias Rodrigo
Borgia, « l'Espagnol », chef des Templiers et le pape en Italie. Après un combat
contre ce dernier dans une chambre secrète se trouvant sous la chapelle Sixtine,
il l'épargne et accède au Sanctuaire. Un hologramme d'une femme se nommant
Minerve l'accueille, et lui explique divers choses qu'Ezio a du mal à
comprendre. Elle lui dit qu'elle ne veut pas parler avec lui mais à travers lui.
Minerve raconte qu'elle est la dernière d'une race avancée qui a créé avec
d'autres de son espèce les êtres humains. Mais ces derniers se sont rebellés,
éclatant ainsi en guerre entre les deux races. Personne n'a pu remarquer que la
force magnétique de la Terre diminuait peu à peu, laissant la Terre sans défense
face aux éruptions solaires. L'une d'elles provoquera une catastrophe terrible,
anéantissant l'humanité et une grande partie du peuple de Minerve. Les quelques
survivants reconstruiront la civilisation, et laisseront derrière eux des
artéfacts pour permettre la survie face à d'autres catastrophes. Minerve raconte
à Desmond qu'il devra chercher les autres temples sacrés construits par sa race
pour pouvoir survivre à la nouvelle tragédie qui approche, et que tout repose
maintenant sur lui. Ezio ne comprend pas la scène à laquelle il vient
d'assister, pas plus que son descendant sortant de la machine. Il n'y a pas de
temps pour se questionner, les Templiers modernes ont attaqué la cachette.
Desmond reçoit une lame secrète et repousse avec succès Warren Vidic accompagné
de gardes grâce aux mouvements de son ancêtre qu'il a assimilés. Les Assassins
montent dans un camion en emportant l'Animus et se dirigent vers une autre
cachette.